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为什么生物指示剂暴露于灭菌循环后依然存活?

发布时间:2022-11-08   点击次数:173次

  当生物指示剂暴露在灭菌循环内,预期所有的测试物品都无菌。灭菌过程中所有关键参数都达标了。生物指示剂被激活和培养。在接下来几天的培养期中,暴露的生物指示剂结果被记录下来。希望除了阳性对照之外,你永远不会看到阳性结果 (黄色)。但如果有一天你把样本从培养器里拿出来,发现了一个意想不到的阳性(黄色)指示剂,你该怎么办呢?

  最近我们收到一位客户的来信,他在使用自含式生物指示剂时遇到了让他感到有所顾虑的情况。灭菌循环是在134°C下7分钟。暴露的指示剂培养48小时检测为阴性(紫色)。然而一些暴露的指示剂在随后的48小时观察中,检测呈阳性(黄色)。最后,客户提到过去他们使用每支含菌量105时,没有经历过“失败"。从那以后他们就改用了106,偶尔会看到48小时后呈现阳性结果的情况 。

  说明书上显示制造商必须遵守FDA缩短培养时间(RIT)的标准,方能标注生物指示剂培养48小时即可出结果(或少于7天的培养期)。测试必须一式三份使用至少三个单独批次,要求100个生物指示剂暴露于部分灭菌循环,使得100个暴露的指示剂中有30至80个呈阳性。

将暴露的生物指示剂进行培养,并在七天内定期对阳性指示剂进行记录。如果48小时内记录的阳性指示剂数量除以7天内的阳性指示剂数量结果大于0.97,那么生物指示剂培养48小时即可出结果的说法就是成立的。例如,到了第7天如果总计观察到78个阳性指示剂,那么至少需要在48小时内记录76个阳性。76 ÷ 78 =0.974 。如果在48小时内检测到75个或更少数量的指示剂呈阳性。那就说明产品没有通过 RIT测试,75÷78=0.962。

  了解了RIT测试的具体情况,可以看出如果培养时间超过标签要求,可能会有更多指示剂呈阳性。然而,RIT测试的目标是“量变区",有些暴露的指示剂为阴性,有些为阳性。常规灭菌循环不针对该区域开发。经验证和批准的灭菌循环旨在实现致死剂量远超孢子灭活的量变区。有效的灭菌循环实现的致死量远超量变区。

  当达到这个量变区时,每个指示剂活孢子数量已降至0、1、2或极少有存活的受损孢子。存活孢子数量为0的指示剂在48小时、7天或以上检测为阴性。具有一个或多个存活孢子的指示剂通常在48小时或更短时间内呈阳性。最后要考虑的是,指示剂如果有一个或两个受损的孢子可能无法生长,修复消毒剂造成的损害,生长、繁殖、代谢培养基中的营养物质,从而产生酸性副产物,导致pH指示剂变成黄色。对于这些指示剂而言,测试结果会呈阴性还是阳性是有疑问的。此外,由于孢子的严重损伤,生长和繁殖可能会延迟,从而在48小时的时间内呈阴性结果,但超过48小时则最终变成黄色。这种现象只会发生在量变区。更长的灭菌时间能成功杀死所有孢子。如上所述,如果没有孢子存活,指示剂将在七天或更长时间后依然检测为阴性。

  为了评估有疑问批次的指示剂的抗性,我们对数据进行回顾,有证据表明48小时后可能出现额外的阳性反应。在抗力仪(BIER)中处理了总共940个EZTest指示剂,来评估121°、124°、129°、132°、134°和135°C温度下的D值。在消耗的940个指示剂中,48小时后仅出现6个额外的阳性指示剂。对于在48小时观察到失活的所有暴露的指示剂而言,在7天的培养过程中没有出现阳性结果。

  在134°C下进行D值评估时,2.0、2.5、3.0和3.5分钟时实现了对孢子的杀灭。正如你所见,如果灭菌达到规定的致死剂量(对应于134°C饱和蒸汽下暴露7.0分钟的生物指示剂,在任何情况下客户都不会看到阳性结果。这个客户在48小时后发现了额外的阳性指示剂,这清楚地表明灭菌循环产生的致死剂量与量变区效果相当。客户的所有暴露指示剂在48小时的时候均呈阴性,48小时后少数呈阳性。这表明致死剂量接近量变区的终点,与我们1.5或2.0分钟BIER循环的情况相似。  

问题仍然存在,为什么指示剂在134°C, 7分钟循环测试中呈阳性?

 抗性准确的生物指示剂在此灭菌循环下可能出现阳性结果的原因有几个:

  1.温度探头显示134°C,但存在错误,灭菌室内的温度其实比这低很多

  2.温度探头显示134°C,是准确的,但不代表放置指示剂的环境中全部都是这个温度。负载内的包装和/或位置可能会阻碍蒸汽渗透到指示剂的位置或指示剂的位置有空气。

  3.压力探头指示的压力与饱和蒸汽相对应条件在134°C(即44.10 psia),但其实有误差,灭菌室内实际上大多数位置的压力是不同的。

  4.压力探头是准确的,但由于在负载内的包装和/或位置的原因,读数不能代表放置指示剂的环境内的普遍情况

  从灭菌室(以及EZTest指示剂)中去除空气和/或通往EZTest指示剂的蒸汽受到了阻碍。在高温和较短的灭菌循环下,这是最常见的问题。由于灭菌循环使用的包装原因,这个问题会更严重。孢子就会对整体的环境作出反应,综合的杀灭效力会比任何测量方式都要精确。(温度和压力探头无法区分饱和蒸汽和干热。)自含式指示剂EZTest可以很好地检测到灭菌循环不足,因为它的功能就像一个气阱。不像STRIP BI的可渗透玻璃纸包装,EZTest进行空气/蒸汽交换的位置是通过排气帽进行的。由于气体交换有限,EZTest创造了一个“最坏的环境",因此可以比任何其他类型的生物指示剂更好地检测排气/蒸汽渗透效率低下的情况。

 另一种可能是暴露和培养的指示剂在培养期内被污染了。污染物导致培养基颜色变化。出现假阳性,其实孢子已经杀灭了。在培养期内晃动、跌落或倒置激活的指示剂都可能导致盖子里的滤纸片变湿,引入污染物的可能性增加。 

  处理后污染是必须考虑的情况。然而,在这个特定的案例中,有一种说法降低了这种情况的可能性。在过去,X10^5的含菌量用户从未遇到过这种问题。换成X10^6 含菌量的EZTest以后才出现这个问题。这表明正在使用的灭菌循环已经提供了一定致死剂量,能够使含菌量较低的指示剂不被激活。当含菌量增加十倍后,致死剂量更高,只是偶尔有一个孢子存活。

  从本质上说,生物指示剂的表现符合它的预期。这就是生物指示剂的使用目的,所以生产无菌产品的企业必须使用生物指示剂;它证明了灭菌室里已经实现了杀灭孢子的条件。结果是一致的。记住,“无菌"一词的定义是所有活的微生物都不存在,而不是根据温度、压力和Fo值来确定。如果您发现自己的指示剂处于探头所指示能杀灭细菌的情况,但结果却呈阳性,记住不论预期的杀灭剂量是怎样的,微生物原本是在灭菌室,现在是在培养器里生长。很明显,指示剂受到的灭菌效力是不够的。


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